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支原體PCR檢測培養(yǎng)方法檢測結(jié)果

更新時間:2018-02-06  |  點擊率:1308
  支原體PCR檢測培養(yǎng)方法檢測結(jié)果
  
  支原體PCR檢測直接培養(yǎng)法
  
  原理:直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中,觀察其生長及菌落生成。
  
  特點:是目前zui直接與靈敏之步驟,亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。
  
  缺點:培養(yǎng)時間長,須3-5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(例如M.hyorhinis)。需同時培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對照組,可能會造成污染。
  
  材枓:dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養(yǎng)皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸(厭氧缸長期培養(yǎng)易有污染,所以厭氧包應(yīng)用無菌水,每次打開厭氧缸后,用70% ethanol擦拭內(nèi)壁。)
  
  污染是細胞培養(yǎng)的大敵,預(yù)防和避免污染是成功培養(yǎng)細胞的關(guān)鍵之一。危機意識要貫徹實驗的始終,否則不僅浪費時間,而且浪費人力、物力,甚至造成無法彌補的損失。
  
  支原體PCR檢測方法與結(jié)果:
  
  1,將已檢測出有支原體污染的細胞以正常傳代密度鋪到6孔板中,一個孔加清除劑,作為測試孔,另一孔不加清除劑,作為陰性對照孔。兩孔之間間隔一個孔,以免互相污染。
  
  2,在清除支原體的過程中細胞以常規(guī)方法傳代培養(yǎng),并使細胞在培養(yǎng)過程中一直處于清除劑的作用下。在加清除劑后第4、8、9、11天各取1毫升培養(yǎng)上清。每份上清與細胞已共培養(yǎng)48小時,除第9天的上清只共培養(yǎng)了24小時。
  
  3,將這些培養(yǎng)上清在16000g離心5分鐘,小心去除離心上清,將沉淀用無菌PBS洗三次,每次以16000g離心5分鐘。zui后獲得的沉淀用100微升純水重懸,在100℃水浴中孵育5分鐘,然后用于PCR反應(yīng)。
  
  4,按照支原體檢測試劑盒的說明書進行PCR檢測操作,結(jié)果如下:
  
  4.1,與對照樣品共同反應(yīng),用這種方式可以判斷是否出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。在加清除劑后第4天的樣品中仍可見到支原體陽性條帶(約440bp),在第8、9、11天的樣品中,已看不到支原體陽性條帶。
  
  4.2,不加對照樣品,檢測樣品單獨反應(yīng),用這種方式可以提高測試靈敏度??梢娫诘?天和第9天的樣品中,支原體陽性條帶仍然出現(xiàn),但是弱于第4天的樣品。在第11天的樣品中,有明顯的200bp以下的非特異的條帶,且亮度高于陽性條帶,所以判斷此時的PCR產(chǎn)物是非特異反應(yīng)的產(chǎn)物,樣品中已沒有支原體DNA。
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