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活細(xì)胞觀察活性染料固定染色法

更新時(shí)間:2022-05-13  |  點(diǎn)擊率:1496

一.活細(xì)胞觀察

鏡下觀察:

細(xì)胞無(wú)色透明,倒置顯微鏡或相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu):細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。

生長(zhǎng)狀態(tài)好:胞內(nèi)無(wú)顆粒,不見空氣,胞膜清晰,上清液透明,無(wú)懸浮細(xì)胞和碎片。

生長(zhǎng)狀態(tài)不好:胞質(zhì)出現(xiàn)空氣脂滴和顆粒狀物,細(xì)胞之間的空隙加大細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。

1.活性染料:

原理:能進(jìn)入活細(xì)胞,一些無(wú)毒或毒性很小的染料,電性吸引而堆積在細(xì)胞中某些特定的結(jié)構(gòu)從而顯色,不引起物理和化學(xué)變化,對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)不會(huì)產(chǎn)生影響或影響很少。

包括:中性紅、結(jié)晶紫、健那綠、次甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、亮焦油紫。

特點(diǎn):它們解離后帶正電荷,屬堿性染料與胞內(nèi)構(gòu)造有一些結(jié)合。

二.固定染色方法

1.固定:迅速殺死細(xì)胞再染色進(jìn)行觀察。

目的:使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、核酸及糖等轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì),避免自溶腐bai。固定的細(xì)胞保持原有結(jié)構(gòu),保存時(shí)間長(zhǎng)。

由于固定劑性能不同,如一種固定劑對(duì)某種結(jié)構(gòu)保存效果好,但對(duì)別的結(jié)構(gòu)就不一定適合,染色劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)成分有不同的親和力,所以每種組織通常有一些特定的固定染色方法。

一.常用固定劑包括:

1.75%酒精、

2.4%多聚甲醛(多聚甲醛為粉末狀,緩慢加入在60℃水浴中溶化),

3.甲醛/冰醋酸(冰醋酸1份:甲醛3份),

4.FAA(80%乙醇90ml、冰醋酸5ml、中性福爾馬林5ml)

5.中性福爾馬林:福爾馬林10ml、Na2HPO4(無(wú)水)0.78g、NaH2PO4(無(wú)水)0.42g加0.85%NaCl至100ml。

6.Carnory固定液:純酒60ml、氯仿30ml、冰醋酸10ml。

二. 染色方法:

使死細(xì)胞著色的大多數(shù)是酸性染料,它們不易穿透活細(xì)胞的質(zhì)膜,進(jìn)入胞內(nèi),卻能滲進(jìn)死亡的細(xì)胞,使死細(xì)胞著色。

(1)臺(tái)盤藍(lán)(trypan bule)

0.4%~1%溶于生理鹽水,pH7.0~7.2,取0.1ml/ml細(xì)胞懸液染色2分鐘后鏡下觀察死細(xì)胞為藍(lán)色。此染色時(shí)間不易過長(zhǎng),有毒性,如染15分鐘以上,活細(xì)胞會(huì)受到損傷而著色。另外,臺(tái)盤藍(lán)不宜久存時(shí)間長(zhǎng)了有毒性。(藍(lán)色)

(2)苯胺黑 (Amiline black)

0.05%苯胺黑Hanks溶液以1:10量細(xì)胞懸液混合1~2分鐘后,鏡下觀察:死細(xì)胞著黑色,苯胺黑染料毒性很小。

(3)赤蘚紅B(Erythrosin B)

PBS或Hanks溶液洗去血清取細(xì)胞與0.02%赤蘚紅B混合,兩小時(shí)之內(nèi)鏡檢:死細(xì)胞著紅色。

(4)伊紅Y(Eosin Y)

細(xì)胞懸液與7倍量的0.15%伊紅Y染液(生理鹽水配制)混合2分鐘后鏡檢,死細(xì)胞為桃紅色。

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